Номер 161, страница 183 - гдз по химии 10-11 класс задачник Еремин, Дроздов

5.161. Какими методами можно определить: а) аминокислотную последовательность белка; б) пространственную структуру белка?

а) аминокислотную последовательность белка

Определение аминокислотной последовательности (первичной структуры) белка является фундаментальной задачей в протеомике. Для этого используют несколько основных методов.

1. Химическое секвенирование по Эдману. Это классический метод, основанный на последовательном отщеплении и идентификации N-концевой аминокислоты полипептидной цепи. Процесс включает реакцию N-концевой аминогруппы с фенилизотиоцианатом (ФИТЦ) с последующим отщеплением производного аминокислоты в кислой среде. Идентификация отщепленного производного (фенилтиогидантоина, ФТГ-аминокислоты) проводится с помощью хроматографии. Цикл повторяется многократно. Метод эффективен для пептидов длиной до 50–60 остатков. Для анализа более крупных белков их предварительно разрезают на более короткие пептиды с помощью ферментов (например, трипсина) или химических реагентов (например, бромциана). Затем последовательности отдельных пептидов определяют и "собирают" полную последовательность белка, используя перекрывающиеся фрагменты.

2. Масс-спектрометрия. Это современный, высокочувствительный и производительный метод. Белок сначала расщепляют на пептиды протеолитическим ферментом. Затем смесь пептидов анализируется. В методе пептидного фингерпринтинга (peptide mass fingerprinting) измеряют массы образовавшихся пептидов и сравнивают их с теоретическими массами пептидов из баз данных, что позволяет идентифицировать белок. Для прямого определения последовательности (de novo секвенирование) используют тандемную масс-спектрометрию (МС/МС). В этом подходе отдельные пептидные ионы отбираются в масс-спектрометре, фрагментируются, и по массам образовавшихся фрагментов восстанавливают аминокислотную последовательность исходного пептида. Масс-спектрометрия также является основным методом для идентификации посттрансляционных модификаций.

3. Секвенирование соответствующего гена. Аминокислотная последовательность белка закодирована в последовательности нуклеотидов гена, который его кодирует. Определив нуклеотидную последовательность ДНК (или мРНК) с помощью методов секвенирования (например, по Сэнгеру или методов нового поколения, NGS), можно, используя генетический код, однозначно "перевести" ее в аминокислотную последовательность. Это наиболее быстрый и дешевый способ узнать теоретическую последовательность белка. Однако этот метод не дает информации о посттрансляционных модификациях и процессинге белка (например, отщеплении сигнального пептида).

Ответ: Аминокислотную последовательность белка можно определить методами химического секвенирования по Эдману, масс-спектрометрии (включая тандемную масс-спектрометрию), а также косвенно — путем секвенирования кодирующего его гена (ДНК) или мРНК с последующим использованием генетического кода.

б) пространственную структуру белка

Определение трехмерной пространственной структуры белка (третичной и четвертичной) является ключевым для понимания его функции. Для этого используются методы структурной биологии с высоким разрешением.

1. Рентгеноструктурный анализ (РСА). Это наиболее распространенный метод. Он требует получения высокоупорядоченного монокристалла белка. Кристалл облучают пучком рентгеновских лучей, которые, рассеиваясь на атомах белка, создают характерную дифракционную картину. Анализ этой картины позволяет рассчитать распределение электронной плотности в кристалле и на его основе построить атомарную модель молекулы белка. Метод позволяет получать структуры с очень высоким разрешением, но его главный недостаток — необходимость кристаллизации, что не всегда возможно, особенно для мембранных белков или гибких белковых комплексов.

2. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Этот метод позволяет определять структуру белков в растворе, что ближе к их нативному состоянию. Метод основан на измерении магнитных свойств атомных ядер (обычно $^1$H, $^{13}$C, $^{15}$N) в сильном магнитном поле. Анализируя сложные многомерные спектры ЯМР, можно определить межатомные расстояния для тысяч пар атомов в молекуле. Этот набор геометрических ограничений используется в компьютерных программах для расчета ансамбля структур, удовлетворяющих экспериментальным данным. Метод ЯМР также предоставляет уникальную информацию о динамике и гибкости белковой молекулы. Основное ограничение — размер белка (обычно до 30-40 кДа).

3. Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ). Это стремительно развивающийся метод, особенно эффективный для анализа крупных белковых комплексов, которые трудно кристаллизовать. Раствор белка очень быстро замораживают, получая тонкий слой стекловидного (аморфного) льда, в котором молекулы белка зафиксированы в случайных ориентациях. Затем с помощью просвечивающего электронного микроскопа получают тысячи двумерных изображений-проекций отдельных молекул. Эти изображения компьютерным образом объединяются для реконструкции трехмерной карты электронной плотности, в которую затем встраивается атомная модель. Современная крио-ЭМ позволяет достигать разрешения, сопоставимого с РСА.

Существуют также методы с более низким разрешением, дающие общую информацию о структуре. Например, спектроскопия кругового дихроизма позволяет оценить процентное содержание элементов вторичной структуры (α-спиралей, β-листов), а малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР) — определить общую форму и размер белка в растворе.

Ответ: Пространственную структуру белка с высоким разрешением определяют методами рентгеноструктурного анализа (РСА), спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ). Информацию о вторичной структуре и общей форме можно получить с помощью спектроскопии кругового дихроизма и малоуглового рассеяния соответственно.